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棠汰汰—刘东波教授论文(稳定表达 RFP-GFP-LC3 的大鼠胰岛 β 细胞株的构建)(3)

2019-09-23 17:08    来源:东方经济网      字号:

  图 3 激光共聚焦下观察 RFP-GFP-LC3 稳定细胞株中自噬体的形成

  (A) 2 h 血清饥饿后 , RFP-GFP-LC3 稳定细胞株中自噬体的形成图 ( 标尺 50 μm); (B) 图 A 中绿色荧光点 / 红色荧光点的统计结果。 **: P<0.01, 与对照组相比 ; #: P<0.05,与饥饿组相比。

  Fig.3 Observation of autophagy formation in RFP-GFP-LC3 stable cell line under laser scanning microscopy(A) The formation of autophagosomes in RFP-GFP-LC3 stable cell line after serum starvation for 2 h (scale bar 50 μm); (B)The cells were treated as described in (A) and the statistical results of green/red fluorescence points were analysed by SPSS 10.0software. **: P<0.01 vs. control group; #: P<0.05 vs. starvation group.

  图 2 RIN-m5f 细胞的荧光显微镜观察图(100×)

  (A) 透射光下的 RIN-m5f 细胞株 ; (B) 绿色荧光下的 RIN-m5f 细胞株 ; (C) 红色荧光下的 RIN-m5f 细胞株。

  Fig.2 The RIN-m5f cells observed by fluorescence microscopy (100×)

  (A) Transmitted light image; (B) Green fluorescence image; (C) Red fluorescence image.

  2.3 自噬诱导后相关蛋白质的表达分析细胞经过无血清饥饿处理 2 h 后用 2% SDS溶液裂解, 收集总蛋白质, 采用 Western-blot 的方法检测自噬相关蛋白质 P62 及 S6K 的表达水平。结果如图 4 所示, 自噬底物 P62 蛋白的水平下降,与此同时 m-TOR 活性评价蛋白质 S6K 的磷酸化水平下降, 由此证明自噬流被成功诱导, 与图 3结果所示一致。

  

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  3 讨论

  近年来, 越来越多的证据表明, 自噬是一种治疗糖尿病的新靶点, 具有多种有益作用。同时许多药物和天然产物通过多种信号途径参与自噬调节, 包括诱导或抑制自噬 [13] 。有实验研究表明传统中药消渴平可通过诱导自噬抑制小鼠胰岛细胞

  在高糖培养下的细胞凋亡 [14] , 这对于糖尿病的研究具有重大意义, 同时也提示自噬的精准检测愈发重要。目前, 通过细胞免疫荧光技术以及 West-ern-blot 对 LC3-Ⅰ和 LC3-Ⅱ的检测, 并不能完整地反映自噬的整体过程。本实验通过慢病毒转染的方法, 将已融合的红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白与 LC3 蛋白转入 RIN-m5f 细胞, 这样能够在较为简单的共聚焦活细胞拍摄下, 清楚观察到细胞自噬的整个过程, 实验简便易行。

  双荧光 RFP-GFP-LC3 体系是比 GFP-LC3更全面可靠的自噬定量分析方法。该体系最大的优点是不需要外加其他药物干预, 可以同时直观地判断细胞自噬活性和自噬流(自噬通量)的变化 [15~16] 。在本研究中, 我们运用慢病毒转染的方法, 成功构建了表达 RFP-GFP-LC3 的大鼠胰岛 β 细胞株,并通过 G418 进行筛选, 运用激光共聚焦拍摄手段进行检测, 发现细胞最终能 100%表达 RFP-GFP-LC3 质粒。在此基础上, 根据 RFP 与 GFP 对pH 的不同适应度 [17~18] , 通过无血清饥饿诱导细胞自噬, 结果显示: 在饥饿条件下, 绿色荧光点因溶酶体环境 pH 较低发生淬灭, 而红色荧光点稳定存在, 因此 GFP/RFP 荧光点的比值下降; 当加入

  10 μmol/L 氯喹部分阻断自噬流后, LC3 无法与溶酶体融合, 绿色荧光点数回升。这一实验现象符合饥饿诱导的自噬情况 [19] 。自噬是一个动态的过程,该双色荧光体系能够准确地同时显示和区分自噬体和自噬溶酶体, 是检测自噬流的最佳方法 [20] 。目前, 双荧光 RFP-GFP-LC3 已经逐渐得到许多学者的认可, 在自噬相关研究中发挥了重要作用 [21~23] 。本实验中, 稳定表达 RFP-GFP-LC3 质粒的大鼠胰岛细胞株的成功构建不仅解决了传统自噬检测手段—— — 细胞免疫荧光技术需要相应一抗/二抗的孵育、实验成本较大、步骤繁琐耗时的缺点 [24] ,而且为自噬在糖尿病的相关研究提供了细胞平台, 有利于自噬相关机理药物在胰岛 β 细胞上的高通量筛选, 为糖尿病药物的开发提供了便利。参考文献(References):[1] WANG P, FIASCHI-TAESCH N M, VASAVADA R C, et al. Di-abetes mellitus-advances and challenges in human β-cell prolif-eration[J]. Nature Reviews Endocrinology, 2015, 11(4): 201-212.[2] PRIYADARSHINI M, WICKSTEED B, SCHILTZ G E, et al. SC-FA receptors in pancreatic beta cells: novel diabetes targets?[J].Trends in Endocrinology & Metabolism, 2016, 27(9): 653-664.[3] YAMAMOTO S, KURAMOTO K, WANG N, et al. Autophagydifferentially regulates insulin production and insulin sensitivi-

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作者:佚名   责任编辑:刘洋
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